中国兰又称东洋兰, 是兰科兰属中的地生兰, 为庞大兰科家族中独特稀少的种属 。它芳花清丽, 高雅幽香, 是我国的传统名花,具有很高的观赏价值和经济价值, 其中不乏珍品, 千金难求 。但传统的分株繁殖, 繁殖系数极低, 带毒株数多, 种性退化 。种子中缺乏胚乳和子叶, 胚发育不完全, 导致常规播种难以萌发 。应用组织培养技术, 开展快速繁殖是开发和发展中国兰花产业的有效途径 。
1 .中国兰茎尖、侧芽组培技术
(1 )采样、消毒与接种
为了尽量减少供样兰花所带病菌, 应采取不施有机肥, 放置在透光避雨处, 当新芽初露时即让幼芽裸露土面等特殊管理措施 。切取6～13 厘米的新芽( 因品种而异取样有差别) , 用锋利刀片除去根、脏物和外包叶2～3 片, 充分洗净 。
在材料上切取2～3 厘米茎顶, 在10%次氯酸钠药液中消毒10 分钟, 若带菌严重, 应用0 .1%升汞和饱和漂白粉上清液交叉消毒 。灭菌后用无菌水冲洗数次, 再放到灭菌滤纸上吸干水分, 然后在解剖镜下, 无菌操作剥取茎尖和腋芽 。如以去病毒为目的, 所剥取的茎尖应在0 .2 毫米以下, 否则可剥取2 毫米以上茎尖, 带2 个叶原基, 以有利于成活 。
(2 )原球茎的诱导
茎尖的启动率和成功率均高于侧芽 。新芽长度的选择无论茎尖或侧芽均以选取9～ 13 厘米长的新芽为佳 。新芽诱导的成功率最高 。培养基的选择因品种而异, 春兰类品种以White+ 1 毫克/ 升6 苄基腺嘌呤+ 5毫克/ 升萘乙酸+ 8 .5% 椰乳; 或B1 1+ 1 毫克/ 升6 苄基腺嘌呤+ 2 毫克/ 升萘乙酸的培养基最优 。“夏惠”、“ 秋素”等品种则以MS+ 0 .5 毫克/ 升6 苄基腺嘌呤+ 1 毫克/ 升萘乙酸+ 0 .5%活性炭培养基最佳 。兰花外植体接种后放置在23～25 ℃的黑暗条件下培养, 1～2 个月后可分化1 至数个乳白色的原球茎, 在解剖镜下观察类似桑果形状的原球突起,以后转绿, 再经培养而呈根状茎( 或呈树枝状的丛生形) 。中国兰经茎尖培养, 在原球茎诱导启动后易褐变死亡, 死亡率有时高达3/ 4 。因此, 应通过采用较大外植体接种, 降低培养温度, 采用暗培养, 减少伤口面, 在培养基中添加褐变抑制剂( 如聚乙烯吡咯烷酮、硫代硫酸钠、芸香赣、柠檬酸等) 或配合应用活性炭等综合措施, 以减轻褐变的不利影响 。
(3 )原球茎的增殖
茎尖、侧芽接种3～6 个月后, 根状茎形成时即可分割继代, 增殖培养基以White 或B11为基本培养基, 附加1～2 毫克/ 升萘乙酸的液体培养基为宜 。放置在慢速转床上加光培养( 1～2 转/ 分钟) , 每隔15 天更换一次培养基, 连续继代3～4 次后, 再转入相同成分、附加有活性炭(0 .3%)和柠檬酸( 500 毫克/ 升) 的固体培养基, 每月继代一次 。液培、固培交替进行 。增殖培养中, 原球茎的分割不可太小, 培养群体不宜太少, 培养液不可过多, 继代培养时间不可太长 。否则,原球茎生长不良, 甚至死亡 。
(4 )成苗和壮苗培养
将原球茎转入B5+ 2～3 毫克/ 升6 苄基腺嘌呤+ 0 .2 毫克/ 升萘乙酸的琼脂培养基上,放置在25 ℃左右, 光强1 000 勒条件下, 不久即可分化芽和根, 从而形成完整的小植株 。
当苗长至2 ～ 3 厘米时, 应及时转入B5+ 2毫克/ 升萘乙酸+ 0 .3%活性炭的培养基中, 让根芽能成比例地正常生长 。壮苗培养以大试管(30 毫米×200 毫米) 为宜, 放置在28℃左右, 光强2 000 勒, 每天光照12 小时的环境中 。当苗高12 厘米以上, 根苗茁壮时即可移栽 。
2 .兰花无菌播种技术
因兰科植物种子皆缺乏发芽所需要的贮藏养分, 人工播种需要在无菌条件下配合适宜的培养基才能萌发 。中国兰因种皮阻碍水分及气体通过, 并含有阻碍发芽的物质, 或因胚活力衰弱等原因, 以至无菌播种时萌发或发芽率极低,其中地生兰发芽率最低 。因此, 要采用无菌播种技术 。
(1 )种子消毒和预处理
取8～9 成熟、尚未爆裂的地生兰蒴果, 先用酒精棉擦去果面脏物, 用消毒刀片将蒴果剖开, 取出种子,用细白布包裹好 。浸入无菌水使之吸胀, 再用无菌滤纸吸干多余水分, 用0 .1 摩尔/ 升氢氧化钾溶液预处理5～10 分钟(氢氧化钾溶液能软化种皮, 去除抑制发芽之化学物质, 显著提高地生兰的萌发率) , 无菌水冲洗3 次( 操作中用玻棒挤压细白布包, 使漂洗充分) , 无菌滤纸吸干水分后, 再放入饱和漂白粉上层清液中消毒10～20分钟, 最后用无菌水冲洗数次, 即可播种 。种子表面消毒以升汞、次氯酸钠和漂白粉效果较好, 双氧水较差, 升汞对形成原球茎后的生长有不良影响, 次氯酸钠、漂白粉则有促进种子萌发和原球茎生长的明显作用 。
(2 ) 播种用培养基
通常采用的培养基有Knudson、Vacin &Went、White、B11等 。地生兰种子以B11或White+ 1 毫克/升6 苄基腺嘌呤+ 1 毫克/ 升萘乙酸+ 0 .3% 活性炭的培养基为最优 。杂交种子则以B11+ 1 毫克/ 升6 苄基腺嘌呤+ 1 毫克/ 升萘乙酸的培养基为佳 。附加萘乙酸能提高兰花种子的萌发率, 但萌发后死亡数增加, 如与6 苄基腺嘌呤配合使用,效果较好 。附加活性炭也能大大减少已萌发种子的死亡率, 尤其能提高地生兰种子的萌发率 。但活性炭对地生兰×气生兰的杂交种子萌发却表现出明显的抑制作用 。
(3 )原球茎培养
兰花种子无菌培养后经暗培养, 萌发形成白色原球茎, 再发育成绿色原球茎(气生兰呈圆球形, 地生兰呈根状) 。放在25 ℃左右的有弱光的地方培养, 原球茎若转入White+ 2 毫克/ 升萘乙酸+ 5%椰乳+ 0 .2%活性炭的培养基中, 可大量增殖 。
(4 )成苗与壮苗培养
根芽分化以B5+ 2 .5毫克/ 升6 苄基腺嘌呤+ 0 .2 毫克/ 升萘乙酸的培养基效果好 。壮苗培养基以B5 最优 。
(5 )试管苗的移栽和养护
【植物组培快繁技术流程 中国兰的组培快繁技术】兰花试管苗“ 自立”能力差, 移栽难度大 。其移栽养护成功的关键技术是: 打开试管塞, 炼苗3～4天苗取出后洗净黏在根上的培养基, 并尽量少伤根 。晾苗后栽植在通气、透水、保湿的介质中 。先在高温弱光条件下缓苗6 ～10天, 然后在15～25 ℃ , 空气相对湿度80%左右的条件下养护, 并注意定期补施营养液 。
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